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一、题文
农杆菌Ti质粒上的T-DNA序列，可以从农杆菌中转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中，导致被插入的基因功能丧失。研究者用此方法构件水稻突变体库，并从中筛选到穗粒数异常突变体。（注：三种限制酶识别序列不同且T-DNA上没有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ的酶切位点）分析回答下列问题：（1）农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞最常见的方法，通常需将目的基因插入到______上，后将重组Ti质粒再转移到______。最后侵染将目的基因插入到植物细胞的染色体DNA上，再经______获得转基因植物。（2）现研究者分别用EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶处理______，用HindⅢ处理野生型的总DNA，处理后进行电泳，使长短不同的DNA片段分离。电泳后的DNA与DNA分子探针（放射性同位素标记的T-DNA片段）进行杂交，结果显示突变体EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种酶切产物均能与探针形成一条杂交带，野生型HindⅢ酶切产物不能形成杂交带。可得出结论：______。（3）由于T-DNA的插入具有随机性，通过突变体水稻基因组与野生型水稻基因组序列比对可确定插入的部位，为实施该比对操作需要利用图中的引物______对下图突变体DNA的______进行PCR扩增。经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T-DNA插入了2号染色体上的B基因中。（4）种植后该突变体产量明显高于野生型，据此推测B基因可能是______（填“促进”或“抑制”）水稻穗粒的形成。
二、解答
Ti质粒的T-DNA 农杆菌体内 植物组织培养 突变体的总DNA 突变体中成功插入了T-DNA，且仅有单个位点插入 ①、④ 未知序列 抑制三、分析
解：（1）农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞最常见的方法，通常需将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，后将重组Ti质粒再转移到农杆菌体内。最后侵染将目的基因插入到植物细胞的染色体DNA上，再经植物组织培养获得转基因植物。（2）现研究者分别用EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶处理突变体的总DNA，用HindⅢ处理野生型的总DNA，处理后进行电泳，使长短不同的DNA片段分离。电泳后的DNA与DNA分子探针（放射性同位素标记的T-DNA片段）进行杂交，结果显示突变体EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种酶切产物均能与探针形成一条杂交带，野生型HindⅢ酶切产物不能形成杂交带。可得出结论：突变体中成功插入了T-DNA，且仅有单个位点插入。（3）由于T-DNA的插入具有随机性，通过突变体水稻基因组与野生型水稻基因组序列比对可确定插入的部位，为实施该比对操作需要利用图中的引物）①、④对下图突变体DNA的未知序列进行PCR扩增。经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T-DNA插入了2号染色体上的B基因中。（4）种植后该突变体产量明显高于野生型，据此推测B基因可能抑制水稻穗粒的形成。故答案为：（1）Ti质粒的T-DNA 农杆菌体内 植物组织培养（2）突变体的总DNA 突变体中成功插入了T-DNA，且仅有单个位点插入（3）①、④未知序列（4）抑制基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生运用所学基础知识，结合所学知识解决相关的生物学问题的能力。本文到此结束，希望对大家有所帮助。
